Membrane e operazioni a membrana nel settore biomedicale e biotecnologico

ABSTRACT

L’attività di ricerca si articola in tre moduli: “Membrane in organi artificiali”, “Operazioni a membrana in processi biotecnologici” e “Sviluppo di una nuova generazione di membrane per i reattori biologici a membrana”.

L’attività di ricerca riguarda lo sviluppo di sistemi bioartificiali avanzati risultanti dalla combinazione delle proprietà biologiche di cellule, proteine, enzimi, con le proprietà strutturali e modulari di sistemi a membrana artificiali. Tali sistemi bioartificiali “custodiscono” il materiale biologico in complessi nano- e micro-strutturati che ottimizzano, la distribuzione, il trasporto e le proprietà funzionali di cellule e macromolecole consentendo il controllo ed il mantenimento delle condizioni “vitali” a medio e lungo termine. Tra gli obiettivi principali vi sono: la realizzazione di organi bioartificiali; di tessuti ingegnerizzati; funzionalizzazione di membrane con cellule o biomolecole; reattori biocatalitici a membrana, emulsificatori a membrana e cristallizzazione a membrana per applicazioni in campo biotecnologico, farmaceutico/terapeutico, alimentare, chimico, bioraffineria e cosmeceutico; sviluppo di membrane per bioreattori per il trattamento delle acque di scarico.

Stato di Avanzamento attività

Attività Svolte

1. Nell'ambito del progetto europeo BIOART FP7-PEOPLE-2012-ITN Project No. 316690 l'attività svolta ha riguardato il consolidamento dei risultati precedentemente ottenuti utilizzando un bioreattore a membrana adoperante sferoidi costituiti da epatociti primari umani. Lo scopo è stato quello di realizzare degli organoidi epatici a partire da sferoidi multicellulari. Gli sferoidi sono stati dapprima realizzati in batch e poi inoculati nello spazio extracapillare di un bioreattore a fibre incrociate costituito da fibre di polietersulfone e fibre di polietereterchetone modificato. E' stato investigato il self-assemblying degli sferoidi nel bioreattore ed il loro processo di fusione che porta alla formazione di micro-tessuti. E' stata quindi valutata l'attività metabolica specifica degli sferoidi nel bioreattore ed il mantenimento della loro funzionalità nel tempo rispetto al sistema a membrana in batch. L'attività ha riguardato anche il consolidamento dei risultati ottenuti dalla relaizzazione di un sistema bioartificiale a membrana organotipico epatico adoperando epatociti, cellule di kupffer e cellule sinusoidali umane allo scopo di ricostruire il tessuto epatico in vitro. Sono state testate e messe a punto le condizioni di co-coltura in batch e nel bioreattore. E' stata quindi valutata la morfologia cellulare nel sistema di co-coltura e le interazioni eterotipiche cellula-cellula. Inoltre, è stato investigato il comportamento morfologico e funzionale delle cellule in particolare la produzione di albumina, la sintesi di urea e la biotrasformazione del diazepam.
2. In collaborazione con il gruppo del Prof. Gabor Forgacs dell'Università del Missouri, è stato valutato il self-assemblying di sferoidi costituiti da fibroblasti, mioblasti e cellule neuronali su membrane polimeriche di chitosano e policaprolattone avente diverse proprietà chimico-fisiche, meccaniche e di permeabilità all'ossigeno, anidride carbonica e azoto. E' stata quindi studiata la velocità di fusione degli sferoidi nei diversi sistemi ed investigato il consumo di ossigeno insieme alla velocità di consumo di glucosio e di produzione di lattato.
3. In collaborazione con l'Università di Helsinki sono stati sviluppati e testati scaffolds costituiti da fibre di acido polilattico (PLA) e scaffolds compositi di PLA e nanoparticelle di idrossiapatite (nHA) realizzati attraverso elettrospinning. E' stata valutata la capacità degli scaffolds di stimolare la crescita e il differenziamento delle cellule osteoprogenitrici e di riprodurre il processo di rimodellamento osseo in vitro adoperando cellule mesenchimali staminali umane isolate da midollo osseo e monociti umani. E' stata studiata l'influenza della concentrazione di nanoparticelle di idrossiapatite sull'osteogenesi e osteoclastogenesi.
4. Un sistema a membrana neuronale costituito da membrane di perfluorocarbonio e cellule ippocampali isolate da criceti è stato adoperato per investigare il ruolo neuroprotettivo del sistema GABAergico durante l'ipossia.
5. Sostituti bioartificiali a membrana della pelle umana sono stati realizzati adoperando cheratinociti e cellule staminali isolati dal derma di pazienti in sistemi omologhi ed eterologhi. Come sistemi a membrana sono state utilizzate membrane di policaprolattone, chitosano e policaprolattone-chitosano.

Reattori biocatalitici a membrana
- Studio della stabilità nel tempo e ottimizzazione di reattori biocatalitici a membrane utilizzando membrane asimmetriche organiche ed inorganiche in configurazione capillare, per l'ottenimento di fitoterapici a partire da materiale di scarto dell'industria olearia.
- Studio e ottimizzazione dei parametri operativi (quantità di enzima immobilizzato, tempo di residenza) in RBM dove l'enzima b-glucosidasi viene immobilizzato in maniera covalente su membrane capillari inorganiche per la produzione di polifenoli.
- Biofunzionalizzazione e caratterizzazione di membrane contenenti particelle paramagnetiche per lo sviluppo di membrane autopulenti (con enzimi pectinolitici) e per la facile rimozione di catalizzatori in RBM.
- Studio ed ottimizzazione di metodologie di immobilizzazione di biomolecole su membrane polimeriche e sviluppo di reattori biocatalitici a membrana per la degradazione di organofosfati in fase liquida, gassosa e aerosol.
- Scale-up di moduli a membrana biocatalitica per la degradazione di organofosfati.
- Sviluppo di membrane bioibride di immunoaffinità nei confronti di IL-6.
- Studio della cinetica di legame di biomolecole su membrane polimeriche con diverse proprietà funzionali.

Emulsificazione a membrana
- Il processo di emulsificazione a membrana è stato utilizzato per la produzione di micro e nano particelle polimeriche a partire da emulsioni del tipo acqua-in-olio ed olio-in-acqua successivamente solidificate tramite reticolazione chimica nel caso del polivinilalcol (PVA) diffusione del solvente nel caso del policaprolattone (PLC) e del Acido poli-lattico-Co-glicolico (PLGA).
- L'emulsificazione a membrana è stata impiegata per la produzione su scala produttiva di nano particelle in PLGA tramite nanoprecipitazione.
- Molecole funzionali quali polifenoli o farmaci quali il desametasone sono state incapsulate nelle particelle prodotte per la realizzazione di sistemi a rilascio controllato.

Cristallizzazione a membrana
Studio degli effetti di superfici polimeriche di membrane in PVDF funzionalizzate con nanospugne di ciclodestrine nella nucleazione eterogenea del paracetamolo, della glicina e dell'acido glutammico. Lo studio è consistito nell' impiego delle membrane a diverso grado di funzionalizzazione e con diverse caratteristiche conformazionali degli additivi allo scopo di controllare i processi di nucleazione eterogenea delle sostanze di interesse farmaceutico. L'attività è stata svolta in collaborazione con Dipartimento di Chimica dell'Università di Torino.

Risultati conseguiti

Nell'ambito della linea: "Membrane in organi artificiali" (PM.P02.008.001) il lavoro ha riguardato l'ottimizzazione di un bioreattore a membrana a fibre incrociate per la realizzazione di organoidi epatici in vitro a partire da sferoidi costituiti da epatociti primari umani. Gli sferoidi inoculati nello spazio extracapillare di un bioreattore formano degli organoidi molto compatti e quindi dei micro-tessuti con una forte interazione cellula-cellula. Un sistema bioartificiale a membrana organotipico è stato realizzato adoperando epatociti, cellule di kupffer e cellule sinusoidali. Il processo di self-assemblying e di fusione di sferoidi tissutali è stato studiato in sistemi a membrana con diverse proprietà chimico-fisiche, meccaniche e di permeabilità all'ossigeno all'anidride carbonica e all'azoto. Il processo di fusione degli sferoidi multicellulari risulta essere fortemente accelerato sulle membrane, in particolare su quelle di policaprolattone, rispetto al substrato inerte come l'agarosio. Sono stati realizzati ed investigati scaffolds di PLA e PLA-nHA a diversa concentrazione di nanoparticelle di idrossiapatite. La concentrazione di HA nello scaffold ha influenzato in vitro il processo di osteogenesi e osteoclastogenesi. Un sistema a membrana neuronale compartimentalizzato in configurazione di sandwich è stato sviluppato per investigare il ruolo neuroprotettivo delle cellule mesenchimali in eventi ischemici. Sono stati sviluppati sistemi epidermici e dermici utilizzando cellule staminali isolati dal derma umano insieme a cheratinociti e membrana biodegradabili di chitosano, policaprolattone e un blend di chitosano e policaprolattone.
Nell'ambito del modulo "Operazioni a membrana in processi biotecnologici" (PM.P02.008.002), reattori biocatalitici a membrana hanno permesso di ottenere fitoterapici a partire da materiale di scarto dell'industria olearia con una conversione del 33%. Sono state prodotte membrane autopulenti contenenti nanoparticelle paramegnetiche biofunzionalizzate con pectinasi. E' stato sviluppato un reattore biocatalitico a membrana per la degradazione di organofosfati in fase liquida, gassosa/vapore e aereosol. Sono state sviluppate membrane che legano in modo specifico l'IL-6 con un'efficienza di circa il 90%. E' stata determinata la cinetica di legame di lipasi, BSA e proteina G su membrane in cellulosa rigenerata. Sono state prodotte particelle multicore-matrix per il coincapsulamento di sostanze idrofile ed idrofobiche utilizzando il PCL come matrice in combinazione con la gelatina di pesce che costituisce il core. L'incapsulamento delle due sostanze modello scelte è stato del 99% nel caso del ferro e del 93% nel caso del tocoferolo. Sono state prodotte microsfere in PVA con dimensioni fino a 1.5 um impiegando il processo di emulsificazione a membrana a flusso pulsato. Nano particelle fino a 300 nm di PLGA-PEG sono state prodotte combinando l'emulsificazione con la nano precipitazione. Sono state preparate diverse membrane polimeriche in PVDF contenenti nanospugne di ciclodestrine a diverso grado di funzionalizzazione e con diverse caratteristiche conformazionali degli additivi, e ne è stata verificata l'abilità nell'aumentare/inibire fenomeni di nucleazione del paracetamolo, della glicina e dell'acido glutammico.
Nell'ambito della linea "Sviluppo di una nuova generazione di membrane per i reattori biologici a membrana" (PM.P02.008.003), membrane sono state prodotte disperdendo la microemulsione polimerizzabile (PBM) su membrane commerciali porose in PES. Nuovi tipi di surfattanti polimerizzabili sono stati sviluppati con e senza POMS. Le membrane sono state prodotte utilizzando dei fotoiniziatori (UV-LED) per la loro polimerizzazione. Membrane contenenti POMS sono state prodotte e testate come catalizzatori per la rimozione di inquinanti dalle acque reflue. La presenza dei POMS nelle membrane prodotte ha dimostrato l'efficienza di tali catalizzatori che vengono attivati una volta additivata H2O2. Infine, il calcolo dell'energie d'interazione tra POMs ed alcuni emulsionanti ha permesso di predire se queste nanoparticelle sono efficacemente legate alla superficie delle membrane, allo scopo di ridurne il rilascio in acqua. Membrane idrofiliche commerciali sono state rese idrofobiche superficialmente effettuando coating con oligomeri fluorurati. Il coating è stato ottimizzato variando la concentrazione e i tempi di polimerizzazione. Le membrane commerciali idrofiliche sono state così modificate con successo senza alterare le caratteristiche strutturali e morfologiche della membrana commerciale. Due algoritmi di calcolo computazionali sono stati implementati. Il primo codice permette di predire il diametro massimo che i nano tubi di carbonio dovrebbero avere per una efficacia reiezione di soluti di piccole dimensioni. Il secondo algoritmo fornisce la frazione della superficie di una membrana che dovrebbe essere ricoperta dai "CNTs inlets" per aumentare la permeabilità della membrana.